N-Acetil-L-Glutamato quinasa de escherichia coli: Estructura tridimensional e implicaciones funcionales

Esta tesis versa sobre el estudio del enzima N-acetil-L-glutamato quinasa (NAGK), no regulado por arginina, de la enterobacteria Escherichia coli. Este enzima cataliza la transferencia del fosfato terminal del ATP al N-acetil-L-glutamato (NAG) en el segundo paso de la ruta de síntesis de arginina en microorganismos y plantas. En el desarrollo de esta tesis doctoral hemos clonado el gen que codifica para la NAGK de E. coli en un vector plasmídico adecuado, hemos sobreexpresado el enzima y lo hemos purificado en un grado muy elevado. Además, se ha conseguido cristalizar el enzima obteniendo varios complejos cristalinos tanto en su forma libre de sustratos como en presencia de varios ligandos, que incluyen sustratos y análogos de los sustratos. El empleo de técnicas de cristalografía de rayos X sobre los cristales obtenidos han permitido determinar las estructuras del complejo del enzima con MgAMPPNP y NAG a 1.5 Å de resolución y las de los complejos con MgADP y NAG con o sin tetrafluoruro de aluminio interpuesto, o de ADP y sulfato, todos ellos a una resolución de 1.9 Å. Todas las estructuras concuerdan en un mismo plegamiento básico, constituido por un homodímero nucleado por una hoja b molecular central de 16 elementos, rodeado de dos capas de hélices a, con bucles y dos hélices emergiendo del borde C-terminal de la hoja b central de cada subunidad, formando dichos bucles los sitios de unión de los sustratos. La estructura concuerda en su mayor parte con la descrita previamente por el laboratorio para la carbamato quinasa (CK), pudiendo constituir la NAGK el paradigma para los demás enzimas de la familia aminoácido quinasa. La presencia en la NAGK de NAG unido permite la caracterización por primera vez del sitio de unión del sustrato a fosforilar en estos enzimas. Además, los diferentes complejos han permitido dilucidar el modo de unión del nucleótido y establecer las bases de la especificidad para el mismo, de la catálisis, así como el curso del grupo fosforilo desde los sustratos a los productos. La comparación con la CK revela un mismo modo de unión de nucleótido a ambos enzimas. Los complejos con MgAMPPNP-NAG y con MgADP-tetrafluoruro de aluminio-NAG revelan que la transferencia de fosforilo sucede en un sólo paso, en línea, con carácter asociativo y con formación de un intermediario pentavalente bipiramidal. Las cargas positivas de dos lisinas conservadas, los extremos N-terminales de dos hélices a y la formación de una red de puentes de hidrógeno del fosfato que se transfiere con la proteína, son elementos catalíticos clave. Un aspartato conservado, tres moléculas fijas de agua y el catión metálico divalente parecen elementos adicionales clave en la organización del centro activo. El centro activo comprime los sustratos en la dirección del intermediario o estado de transición, proponiéndose que la complementariedad del enzima con dicho intermediario estabiliza este último y es un elemento catalítico clave con este enzima. Se propone también que el centro activo sufre fuertes cambios conformacionales con la unión de los sustratos, y que parte de la energía de dicha unión de los sustratos se utiliza para la generación de la conformación catalíticamente productiva.La presencia de una molécula de AMPPNP unida periféricamente al enzima, muy extendida, no acomplejada con Mg2+, nos informa acerca de la conformación que adopta el nucleótido en solución o en sus colisiones con moléculas de proteína. La hipótesis de que este nucleótido tenga importancia funcional para la reacción de la NAGK no parece apoyada por la ausencia del nucleótido periférico en los demás complejos. Por último, se han iniciado los estudios para la caracterización de las bases moleculares de la inhibición "feed-back" de la NAGK por arginina, mediante la cristalización de la NAGK de Pseudomonas aeruginosa, que a diferencia del enzima de E. coli, está sometida a este tipo de inhibición.N-acetyl-L-glutamate kinase (NAGK) catalyzes the second step of microbial arginine biosynthesis. The gene for Escherichia coli NAGK was cloned and expressed in E. coli, allowing enzyme purification and crystallization with and without substrates. The E. coli NAGK crystal structure to 1.5 Å resolution reveals a 258-residue subunit homodimer nucleated by a central 16-stranded molecular open _-sheet sandwiched between _-helices. In each subunit MgAMPPNP binds along the sheet C-edge, and N-acetyl-L-glutamate (NAG) binds near the dyadic axis with its _-carboxilate aligned at short distance from the _-phosphoryl. The structural resemblance with carbamate kinase and sequence alignment suggest that NAGK is the prototype for the amino acid kinase family. Moreover, a large volume of unexplained electron density in this crystal is interpreted as an external, very extended, metal-free AMPPNP molecule that occupies two alternative positions and that makes contacts with the protein exclusively through its _-imidophosphate.We determine here also the crystal structures of NAGK complexes with MgADP and NAG alone or with the transition-state analog AlF4- and with ADP and sulphate. Comparison of these structures allows to delineate three successive steps during phosphoryl transfer. The transfer occurs in line and is strongly associative, with Lys8 and Lys217 stabilizing the transition state and the leaving group, respectively. Three water molecules play, together with Asp162 and the Mg, crucial structural roles. Two glycine-rich loops are also very important, moving in concert with the ligands. The active site is too narrow to accommodate the substrates without compressing the reacting groups, and this compressive strain appears a crucial component of the catalytic mechanism of NAGK. Initial binding of the two substrates would require a different enzyme conformation with a wider active site, and the energy of substrate binding would be used to change the active center conformation.In many species, NAGK is the pathway-controlling enzyme and is subject to feedback inhibition by arginine. The arginine-inhibitable NAGK from Pseudomonas aeruginosa has been cloned, overexpressed, purified and crystallized in presence of MgADP and NAG. Prismatic crystals diffract to 2.75 Å resolution with space group P1. Self-rotation function suggest the presence of 3-7 dimers in the unit cell

Evaluación de competencias docentes de instituciones públicas mexicanas de nivel medio superior

[ES] En la primera década del siglo XXI, en México, se ha intentado implementar un modelo educativo distinto al tradicional, conocido como “modelo de educación basada en competencias” en respuesta a las necesidades laborales que origina la sociedad del conocimiento y/o de la información. Diversas investigaciones se han centrado en observar los procesos de evaluación, el desempeño, el análisis del proceso de enseñanza-aprendizaje de los docentes desde diversas perspectivas; sin embargo, en este trabajo se aborda el análisis de las competencias docentes de forma cualitativa y cuantitativa para el nivel medio superior desde la propuesta de la Reforma Integral de la Educación Media Superior acuerdo 447 publicadas en el Diario Oficial de la Federación en el año 2008. El estudio realizado involucra la comparación de dos unidades de académicas de la Universidad Autónoma del Estado de Guerrero, UAGro. El instrumento de evaluación empleado fue un cuestionario de 98 reactivos con una escala tipo likert constituyendo un inventario y diagnóstico acerca de las competencias docentes con que cuentan los profesores del Nivel Medio Superior. Se encuentra estructurado en seis ejes interdisciplinarios: los saberes pedagógicos; organización de la enseñanza; comunicación; interacción; intervención pedagógica; y desarrollo profesional. Los resultados evidencian que los docentes emplean en mayor proporción la tecnología para desempeñar sus actividades profesionales, es decir, su estilo de enseñanza se basa en el uso de las TIC fortaleciendo sus quehaceres educativos. En general, las habilidades más valoradas y utilizadas por los docentes son saberes pedagógicos e interacción social y las menos valoradas son comunicación, interacción psicopedagógica.Ruiz Gil, Y.; Ortiz Espinoza, J.; Carreto Bernal, F. (2020). Evaluación de competencias docentes de instituciones públicas mexicanas de nivel medio superior. Editorial Universitat Politècnica de València. 711-718. https://doi.org/10.4995/INN2019.2019.10157OCS71171

Detection of partial occlusions of assembled components to simplify the disassembly tasks

An automatic disassembly cell requires of a computer vision system for recognition and localization of the products and each of theirs components. The detection of occlusions adds more information to the knowledge base to identify components and products, and generate a trustworthy and precise relational model (generic graph of hierarchic relations among the different components that make up the product). In this paper, a method to detect partial occlusions in assembled components is presented. This method is based on the fusion of regions and edges information, and it offers a certain degree of simplification for the recognition and modelled of the disassembly tasks, of the set of components which compose the product. The proposed approach to detect regions is a hybrid approach between RGB and HSV spaces. The bi-dimensional histogram V/S is employed for the selection of the appropriate thresholds which serve as an aid to diminish the influence of the highlights and shadows in images. The goal of this paper is to present an approach for the detection of occlusions in assembled components from a combination of HSV and RGB spaces, a bi-dimensional histogram and an edge detector.This work was funded by the following Spanish MCYT project “DESAURO: Desensamblado Automático Selectivo para Reciclado mediante Robots Cooperativos y Sistema Multisensorial” (MCYT (DPI2002-02103)

A Novel Two-domain Architecture Within the Amino Acid Kinase Enzyme Family Revealed by the Crystal Structure of Escherichia coli Glutamate 5-kinase

Glutamate 5-kinase (G5K) makes the highly unstable product glutamyl 5-phosphate (G5P) in the initial, controlling step of proline/ornithine synthesis, being feedback-inhibited by proline or ornithine, and causing, when defective, clinical hyperammonaemia. We determined two crystal structures of G5K from Escherichia coli, at 2.9 Å and 2.5 Å resolution, complexed with glutamate and sulphate, or with G5P, sulphate and the proline analogue 5-oxoproline. E. coli G5K presents a novel tetrameric (dimer of dimers) architecture. Each subunit contains a 257 residue AAK domain, typical of acylphosphate-forming enzymes, with characteristic α3β8α4 sandwich topology. This domain is responsible for catalysis and proline inhibition, and has a crater on the β sheet C-edge that hosts the active centre and bound 5-oxoproline. Each subunit contains a 93 residue C-terminal PUA domain, typical of RNA-modifying enzymes, which presents the characteristic β5β4 sandwich fold and three α helices. The AAK and PUA domains of one subunit associate non-canonically in the dimer with the same domains of the other subunit, leaving a negatively charged hole between them that hosts two Mg ions in one crystal, in line with the G5K requirement for free Mg. The tetramer, formed by two dimers interacting exclusively through their AAK domains, is flat and elongated, and has in each face, pericentrically, two exposed active centres in alternate subunits. This would permit the close apposition of two active centres of bacterial glutamate-5-phosphate reductase (the next enzyme in the proline/ornithine-synthesising route), supporting the postulated channelling of G5P. The structures clarify substrate binding and catalysis, justify the high glutamate specificity, explain the effects of known point mutations, and support the binding of proline near glutamate. Proline binding may trigger the movement of a loop that encircles glutamate, and which participates in a hydrogen bond network connecting active centres, which is possibly involved in the cooperativity for glutamate. © 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.This work was supported by grants BFU2004-05159, BFU2004-04472 from the Spanish Ministry of Education and Science, and PI052838 from the Spanish Ministry of Health.Peer Reviewe

MOGEDA : Modelo Genérico de Desensamblado Automático

El desensamblado de productos es la clave del proceso de reciclado. En este artículo se plantea el modelado del proceso de desensamblado automático de productos. Se estudian, tanto los requerimientos necesarios para poder abordar el proceso de forma automática, como las herramientas necesarias para poderlo llevar a cabo: base de conocimiento basada en modelos y técnicas de reconocimiento y localización tridimensional de objetos mediante visión artificial.Tanto los trabajos realizados como los futuros están enmarcados en el proyecto de la CICYT “Sistema Robotizado de Desensamblado Automático basado en Modelos y Visión Artificial” (TAP1999-0436)

NGC1600 - Cluster or Field Elliptical?

A study of the galaxy distribution in the field of the elliptical galaxy NGC1600 has been undertaken. Although this galaxy is often classified as a member of a loose group, all the neighbouring galaxies are much fainter and could be taken as satellites of NGC1600. The number density profile of galaxies in the field of this galaxy shows a decline with radius, with evidence of a background at approximately 1.3 Mpc. The density and number density profile are consistent with that found for other isolated early-type galaxies. NGC1600 appears as an extended source in X-rays, and the center of the X-ray emission seems not to coincide with the center of the galaxy. The velocity distribution of neighbouring galaxies has been measured from optical spectroscopic observations and shows that the mean radial velocity is approximately 85 km/s less than that of NGC1600, indicating that the centre of mass could lie outside the galaxy. The velocity dispersion of the `group' is estimated at 429 km/s. The inferred mass of the system is therefore of the order of 10^14 solar masses, a value that corresponds to a large group. NGC1600 therefore shares some similarities, but is not identical to, the `fossil clusters' detected in X-ray surveys. Implications of this result for studies of isolated early-type galaxies are briefly discussed.Comment: 8 pages, 5 figures and 2 table, accepted for publication in the Ap

Effects of nitrogen-doped multiwall carbon nanotubes on murine fibroblasts

"The effect of nitrogen-doped multiwall carbon nanotubes (CNx) on the proliferation of NIH-3T3murine fibroblasts is presented. CNTs were dispersed in distillated water and incubated with mammalian cells in order to evaluate their toxicity. Also, the influence of factors such as dosage (7 and 70 mu g/mL), exposure time (24 to 96 h), and the exposure route (before and after cell liftoff) on the cell proliferation was evaluated. When the CNx were simultaneously incubated with the cells, the control culture reached a maximum cell concentration of 1.3 x 10(5) +/- 3.4 x 10(4) cells per well at 96 h, whereas cultures with 7 mu g/mL reached a concentration of 2.6 x 10(4) +/- 5.3 x 10(3) cells. In the case of 70 mu g/mL of CNx most of the cells were dead. The CNx that were added 24 h after cell dissociation showed that live cells decreased, with a cell concentration of 9.6 x 10(4) +/- 9 x 10(3) for 7 mu g/mL and 5.5 x 10(4) +/- 9.5 x 10(3) for 70 mu g/mL, in contrast to control cultures with 1.1 x 10(6) +/- 1.5 x 10(4). The results showed that the CNx had cytotoxic effects depending on the concentration and exposure route.

VISUAL : herramienta para la enseñanza práctica de la visión artificial

En este artículo se presenta un enfoque práctico para la enseñanza de la visión artificial en la asignatura de “Robots y Sistemas Sensoriales” impartida por el área de Ingeniería de Sistemas y Automática en la Universidad de Alicante. En primer lugar, se describe la herramienta VISUAL que ha sido desarrollada por miembros del grupo de Automático, Robótica y Visión Artificial y que permite al alumno especificar un algoritmo de procesamiento de imágenes mediante un esquema gráfico formado por un conjunto de diferentes módulos básicos de procesamiento. Así, la herramienta VISUAL proporciona un interfaz para la visión artificial de manejo intuitivo, al mismo tiempo que permite desarrollos de algoritmos fácilmente comprensibles gracias a su escalabilidad y modularidad, posibilitando realizar etapas de procesamiento claramente definidas. Además, se comentan algunos de los experimentos prácticos propuestos y desarrollados haciendo uso de VISUAL y destinados al reconocimiento y localización de objetos para su posterior manipulación con un robot

Virtual remote laboratory for teaching of computer vision and robotics in the University of Alicante

Comunicación presentada en IBCE'04, Second IFAC Workshop on Internet Based Control Education, 5-7 septiembre 2004, Grenoble, FranciaIn this article, we describe the virtual and remote laboratory for computer vision and robotics education at the University of Alicante (Spain). Its aims are to provide access for all the students to the available robotic and computer vision equipments, generally limited, due to its high cost

Laboratorio Virtual Remoto para Robótica y Evaluación de su Impacto en la Docencia

[ES] Es conocido que un laboratorio virtual puede aportar muchas ventajas en la docencia de asignaturas técnicas, pero también resulta de interés evaluar el grado de aceptación del alumnado. En este artículo se presentan las características principales de un laboratorio virtual con acceso remoto utilizado por los autores en prácticas de una asignatura robótica, centrándose después en un estudio sobre el impacto que tiene esta nueva herramienta docente en los alumnos y en el proceso de enseñanza-aprendizaje. A partir de los resultados del estudio se extraen unas conclusiones que convendría tener en cuenta en la aplicación de los laboratorios virtuales.Agradecemos al Instituto de Ciencias de la Educación (ICE) y al Vicerrectorado de Estudios e Innovación Docente de la Universidad de Alicante sus ayudas para la investigación en laboratorios virtuales aplicados a la docencia. Asimismo, agradecemos la ayuda I+D de la Agencia Valenciana de Ciencia y Tecnología de la Generalitat Valenciana al proyecto “Telemanipulación de Robots a través de Internet mediante Entornos Virtuales y Realimentación Multisensorial”.Candelas, FA.; Torres, F.; Gil, P.; Ortiz, F.; Puente, S.; Pomares, J. (2010). Laboratorio Virtual Remoto para Robótica y Evaluación de su Impacto en la Docencia. Revista Iberoamericana de Automática e Informática industrial. 1(2):49-57. http://hdl.handle.net/10251/146674OJS49571